飼用酶制劑是一種以酶為主要功能性因子，通過(guò)特定生產(chǎn)工藝加工而成的飼料添加劑。飼用酶制劑可刺激內(nèi)源消化酶分泌，降低腸道食糜黏度，**飼料轉(zhuǎn)化率；減少或**飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子；**機(jī)體免疫抵抗能力，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物健康生長(zhǎng) 。目前，酶制劑在飼料中的應(yīng)用主要集中于畜禽方面， 在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用僅見(jiàn)于草魚(yú) 、異育銀鯽、尼羅羅非魚(yú) 、大黃魚(yú)等少數(shù)種類，在刺參上的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

刺參屬海參綱，海參科。近年來(lái)隨著刺參食用和**價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn)，其越來(lái)越受到養(yǎng)殖者和消費(fèi)者青睞。隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種病害及環(huán)境脅迫影響也愈漸顯著，給刺參養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。酶制劑作為一種綠色環(huán)保、無(wú)**殘留的新型飼料添加劑，可有效**養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和疾病抵抗能力，得到了許多研究者的關(guān)注 。刺參飼料中含有大量的纖維素和半纖維素，很難被直接吸收利用。酶制劑能破壞植物細(xì)胞壁，將植物纖維分解為容易被吸收利用的小分子多糖或葡萄糖，促進(jìn)內(nèi)源酶的分泌，**飼料利用率。本試驗(yàn)擬通過(guò)研究幾種單體酶及其復(fù)合酶對(duì)刺參生長(zhǎng)、體成分、免疫能力及氨氮脅迫下免疫酶活力和熱休克蛋白70含量的影響，以期為酶制劑在刺參配合飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，促進(jìn)綠色飼料添加劑的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)５ 個(gè)組，分別為對(duì)照組、木聚糖酶組、纖維素酶組、淀粉酶組和復(fù)合酶組，每個(gè)組３ 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)體重（4.02 ± 0.04） ｇ 的幼參40頭。試驗(yàn)所用木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶活力分別為10000、1000、2000 Ｕ ／ ｇ。共配制粗蛋白質(zhì)含量為20％ 的５ 種試驗(yàn)飼料，首先配制不添加酶制劑的基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照，然后分別以0.04％木聚糖酶、0.10％ 纖維素酶、0.01％ 淀粉酶、0.15％復(fù)合酶（由0.04％ 木聚糖酶、0.10％ 纖維素酶和0.01％淀粉酶組成）等量替代基礎(chǔ)飼料中的α－淀粉。飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表１。固體原料超微粉碎過(guò)200 目標(biāo)準(zhǔn)篩，按配比稱重，加入新鮮魚(yú)油及適量蒸餾水混勻，用小型顆粒飼料擠壓機(jī)制成直徑為0.3ｃｍ 的顆粒，60 ℃ 烘干，用小型粉碎機(jī)破碎，篩選粒度在80 ～ 100 目之間的顆粒備用。

1.2　飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院東營(yíng)試驗(yàn)基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，試驗(yàn)用刺參為該基地當(dāng)年繁育的同一批參苗。試驗(yàn)開(kāi)始前，將1000 頭刺參幼參放養(yǎng)于養(yǎng)殖系統(tǒng)中，暫養(yǎng)15ｄ，期間投喂基礎(chǔ)飼料，待其完全適應(yīng)飼養(yǎng)條件后，選擇體質(zhì)健壯、體重（4.02 ±0.04）g的刺參幼參600頭，平均放養(yǎng)于15個(gè)圓柱形玻璃鋼養(yǎng)殖桶中。每種飼料投喂３ 個(gè)養(yǎng)殖桶，試驗(yàn)期為56ｄ。試驗(yàn)在微流水環(huán)境中進(jìn)行，采用充氣增氧，保證溶氧濃度＞7ｍｇ ／ Ｌ，控制水溫在18～ 20 ℃ ，ｐＨ7.8～8.2，鹽度24～26，亞硝酸氮濃度＜0.05 ｍｇ ／ Ｌ、氨氮濃度＜0.05 ｍｇ ／ Ｌ。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)56ｄ，每天投喂２次（08：00、16：30），日投喂量為刺參體重的２％，根據(jù)試驗(yàn)刺參攝食情況及時(shí)調(diào)整投喂量。每隔２ｄ吸底１ 次，用虹吸法將殘餌及糞便吸出。

1.3　樣品收集

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食48ｈ，記錄每桶刺參總數(shù)并稱量總重，用于成活率、增重率及特定生長(zhǎng)率的計(jì)算。每桶取10 頭刺參，用濾紙輕輕吸干體表水分，稱體重，待其自然舒展后量體長(zhǎng)，用于肥滿度的計(jì)算。用２ ｍＬ 無(wú)菌注射器抽取體腔液后，置冰盤上解剖，分別稱量體壁與腸道重量，并測(cè)量腸道長(zhǎng)度。體腔液在４ ℃ 條件下，以3000ｒ/ｍｉｎ 離心15ｍｉｎ，取上清液分裝于２ ｍＬ 的離心管中，同體壁、腸道樣品一同保存于－80 ℃ 冰箱，待測(cè)。

1.4　氨氮脅迫試驗(yàn)

樣品收集后，封閉循環(huán)水系統(tǒng)， 用氯化銨（NH４Cｌ）調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水氨氮濃度約為５ｍｇ ／ Ｌ，繼續(xù)飼養(yǎng)試驗(yàn)刺參５ｄ，并分別在試驗(yàn)的０、24、48、72、96、120ｈ 采集試驗(yàn)刺參的體腔液，用于免疫酶活力和HSP70 含量的測(cè)定。

1.5　測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1　生長(zhǎng)指標(biāo)

成活率（％）＝ （試驗(yàn)?zāi)﹨⒖倲?shù)／試驗(yàn)初參總數(shù)）×100；

增重率（％）＝ ［（試驗(yàn)?zāi)﹨⒖傊兀�試�?yàn)初參總重） ／ 試驗(yàn)初參總重］×100；

特定生長(zhǎng)率（％／ｄ）＝ ［（ｌｎ 試驗(yàn)?zāi)┢骄鶇⒅兀?span style="line-height:1.6;">ｌｎ 試驗(yàn)初平均參重） ／ 試驗(yàn)天數(shù)］×100；

肥滿度（％）＝ （體重／ 體長(zhǎng)³）×100；

臟體比（％）＝ （內(nèi)臟重／ 體重）×100；

腸體比（％）＝ （腸重／ 體重）×100；

腸長(zhǎng)比（％）＝ （腸長(zhǎng)／ 體長(zhǎng)）×100。

1.5.2　飼料及體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

飼料及體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分采用常規(guī)方法測(cè)定：干物質(zhì)含量采用１０５ ℃ 烘干至恒重法（ＧＢ ／ Ｔ6435—2006）；粗蛋白質(zhì)含量采用杜馬斯燃燒法（Ｌｅｃｏ⁃ＦＰ528）；粗脂肪含量采用索氏抽提法（ＧＢ ／Ｔ 6433—1994）；粗灰分含量采用550 ℃ 馬福爐灼燒法（ＧＢ ／ Ｔ 6438—2007）；木聚糖含量采用分光光度法；粗纖維含量采用過(guò)濾法（ ＧＢ ／ Ｔ 6434—2006）； 淀粉含量采用旋光法（ ＧＢ ／ Ｔ 20194—2006）；能量采用燃燒法（ＰＡＲＲ，6100）。

1.5.3　免疫酶活力的測(cè)定

溶菌酶（ＬＺＭ） 活力采用空白對(duì)照比濁法測(cè)定；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力采用羥胺法測(cè)定，定義為每毫升反應(yīng)液中ＳＯＤ **率達(dá)５０％ 時(shí)所對(duì)應(yīng)的ＳＯＤ 量為１ 個(gè)活力單位（Ｕ）；過(guò)氧化氫酶（ＣＡＴ）活性采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)法測(cè)定，定義為每毫升體腔液每秒鐘分解１ μｍｏｌ 的過(guò)氧化氫（Ｈ２ Ｏ２ ）的量為１ 個(gè)活力單位（Ｕ）。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4　ＨＳＰ７０ 含量的測(cè)定

ＨＳＰ７０ 含量采用上海拜沃生物科技有限公司的試劑盒以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ＥＬＩＳＡ）法進(jìn)行測(cè)定。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品加入到純化的海參ＨＳＰ７０ 單克隆抗體包被的微孔板中，加入酶聯(lián)親和物，３７ ℃ 孵育６０ ｍｉｎ，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物Ａ 和Ｂ，底物３，３′，５，５′－四甲基聯(lián)苯胺（ＴＭＢ）在辣根過(guò)氧化物酶（ＨＲＰ） 催化下先轉(zhuǎn)化為藍(lán)色后變?yōu)辄S色。在４５０ ｎｍ 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（ＯＤ）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的ＯＤ 值計(jì)算樣品中ＨＳＰ７０ 的含量。

1.6　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2007及spss11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-wayANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ｍｅａｎ ±ＳＤ） 表示，差異顯著（Ｐ＜0.05）時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析。

2　結(jié)果

2.1　 酶制劑對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響

由表２ 可見(jiàn)，飼料中添加木聚糖酶、纖維素酶和復(fù)合酶均能顯著**刺參的增重率和特定生長(zhǎng)率（Ｐ＜0.05），且添加木聚糖酶和復(fù)合酶的促生長(zhǎng)效果尤其明顯，其增重率分別比對(duì)照組**了17.38％和20.75％。木聚糖酶組的臟體比和腸長(zhǎng)比均顯著高于對(duì)照組（Ｐ ＜0.05），纖維素酶組的臟體比顯著高于對(duì)照組（Ｐ ＜0.05），淀粉酶組的肥滿度顯著高于對(duì)照組（Ｐ＜0.05），復(fù)合酶組的肥滿度、臟體比、腸體比和腸長(zhǎng)比均顯著高于對(duì)照組（Ｐ ＜0.05）。飼料中添加單體酶和復(fù)合酶對(duì)成活率也有一定**，但影響不顯著（Ｐ＞0.05）。

2.2　酶制劑對(duì)刺參體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表３ 可見(jiàn)，飼料中添加不同酶制劑對(duì)刺參體壁水分含量無(wú)顯著影響（Ｐ＞0.05），但添加木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和復(fù)合酶均顯著**了體壁粗蛋白質(zhì)和粗灰分的含量（Ｐ ＜0.05），添加淀粉酶和復(fù)合酶均顯著**了體壁粗脂肪的含量（Ｐ＜0.05）。

2.3   酶制劑對(duì)刺參免疫能力的影響

由表４ 可見(jiàn)，飼料中添加木聚糖酶、纖維素酶和復(fù)合酶均顯著**了體腔液中過(guò)氧化氫酶的活力（Ｐ ＜ 0.05）；添加淀粉酶顯著**了體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活力（Ｐ＜0.05）。體腔液中溶菌酶和超氧歧化酶活力均以淀粉酶組**高，過(guò)氧化氫酶活力以復(fù)合酶組**高。

2.4　酶制劑對(duì)氨氮脅迫下刺參體腔液中免疫酶活力和ＨＳＰ７０ 含量的影響

由圖１ 可見(jiàn)，氨氮脅迫過(guò)程中各組刺參體腔液中溶菌酶活力的總體趨勢(shì)是先升高后降低，對(duì)照、木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、復(fù)合酶組**大值分別出現(xiàn)在７２、７２、９６、９６ 和９６ ｈ。其中，淀粉酶、復(fù)合酶組的**大值要高于其余各組。氨氮脅迫過(guò)程中各組刺參體腔液中ＳＯＤ 活力均先升高，并均在２４ ｈ 達(dá)到**大值，之后降低并于４８ ｈ 后趨于穩(wěn)定，且其穩(wěn)定值略低于初始值。氨氮脅迫過(guò)程中各組刺參體腔液中ＣＡＴ 活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并均在９６ ｈ 達(dá)到**大值，其中淀粉酶組的**大值要高于其他各組。

氨氮脅迫下，試驗(yàn)初期復(fù)合酶組刺參體腔液中ＨＳＰ７０ 含量明顯高于其他各組。木聚糖酶組刺參體腔液中ＨＳＰ７０ 的含量呈現(xiàn)一直升高的趨勢(shì)，其余各組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。復(fù)合酶組體腔液中ＨＳＰ７０ 含量比其他組率先達(dá)到**高點(diǎn)，且在９６ ｈ 后趨于穩(wěn)定。對(duì)照、纖維素酶、淀粉酶組體腔液中ＨＳＰ７０ 含量于９６ ｈ 達(dá)到**大值。除纖維素酶組外，其余加酶組體腔液中ＨＳＰ７０ 含量的**大值均高于對(duì)照組。

3　討論

3.1　酶制劑對(duì)刺參生長(zhǎng)性能和體成分的影響

本研究表明，飼料中添加酶制劑顯著**了刺參的增重率和特定生長(zhǎng)率，這與在鯽魚(yú) 、尼羅羅非魚(yú)、黃河鯉和大西洋鮭上的研究結(jié)果相一致。

酶制劑促進(jìn)刺參生長(zhǎng)，可能有以下幾方面原因：

１）飼料中添加木聚糖酶能有效降低腸道食糜黏度，降解非淀粉質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子，**養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而改善養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能。

２）纖維素酶能破壞細(xì)胞壁、降低飼料密集黏度，同時(shí)刺激內(nèi)源酶的分泌，從而**水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收。

３） 飼料中添加淀粉酶起作用的主要為α－淀粉酶和糖化酶。α－淀粉酶為內(nèi)切酶，將淀粉大分子水解成易溶解的中等和低分子物質(zhì)，有利于糖化酶的水解。糖化酶為內(nèi)切酶，其活性的高低直接影響到動(dòng)物的生長(zhǎng)。

４） 復(fù)合酶綜合了幾種單體酶的作用，又不僅僅是單個(gè)酶作用的復(fù)合。

鄧岳松在研究中發(fā)現(xiàn)由纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等組成的復(fù)合酶對(duì)飼料中的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子具有滅活作用，可**草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收困難，從而**魚(yú)體的生長(zhǎng)性能。黃峰等 研究表明，添加復(fù)合酶促進(jìn)異育銀鯽生長(zhǎng)的效果稍好于單一添加木聚糖酶，這可能得益于復(fù)合酶的疊加效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，添加復(fù)合酶的促生長(zhǎng)效果優(yōu)于添加單體酶。

本研究表明，飼料中添加酶制劑對(duì)刺參體壁粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均有顯著影響。這與王俊麗等 、黃燕華等的研究結(jié)果相一致。飼料中添加木聚糖酶能**腸道蛋白酶活力，增加腸道內(nèi)游離氨基酸和小肽數(shù)量，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和積累。同時(shí)，添加木聚糖酶降低了腸道食糜黏度，腸道活動(dòng)增強(qiáng)，從而促進(jìn)了對(duì)脂肪的吸收，增加了體壁中脂肪的沉積。添加木聚糖酶使腸道中低聚木糖增加，低聚木糖的代謝降低了腸道ｐＨ，增強(qiáng)了鈣鹽的溶解性，促進(jìn)了鈣的吸收，從而**了粗灰分的含量。而鐘國(guó)防等、張璐等的研究證明，飼料中添加酶制劑對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的基本營(yíng)養(yǎng)成分均無(wú)顯著影響。這可能與添加酶的種類、活力及養(yǎng)殖動(dòng)物種類有關(guān)。

3.2　酶制劑對(duì)刺參免疫能力的影響

刺參沒(méi)有完善的特異性免疫，溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶在其免疫及抗氧化過(guò)程中起著重要作用。溶菌酶活力的高低直接反映出溶菌能力的強(qiáng)弱，超氧化物歧化酶活力與生物體免疫水平密切相關(guān) ，過(guò)氧化氫酶保護(hù)機(jī)體組織免受損害。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加酶制劑對(duì)刺參各免疫指標(biāo)均有促進(jìn)作用。其中，木聚糖酶組體腔液中溶菌酶和過(guò)氧化氫酶活力與對(duì)照組相比有顯著**；淀粉酶體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活力均較對(duì)照組有顯著**。這與黃燕華等、鐘國(guó)防等、黃峰等的研究結(jié)果一致。黃燕華等 研究證實(shí)，飼料中添加淀粉酶能顯著**對(duì)蝦血清超氧化物歧化酶活力。鐘國(guó)防等研究表明，在尼羅羅非魚(yú)飼料中添加木聚糖酶和復(fù)合酶能顯著**魚(yú)體肝臟和脾臟中超氧化物歧化酶和溶菌酶活力。目前關(guān)于刺參體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶正常活力范圍的研究并不充足，尤其是酶活力升高的機(jī)理尚不清楚，因此不能單純依據(jù)酶活力來(lái)評(píng)定其免疫及抗氧化能力的強(qiáng)弱，但是在大菱鲆等魚(yú)類上的研究表明，魚(yú)體抗病能力的**往往伴隨著溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活力的升高，由此可以推測(cè)在一定范圍內(nèi)，上述３ 種酶活力的升高**了機(jī)體的抗逆性。

3.3　酶制劑對(duì)氨氮脅迫下刺參體腔液中免疫酶活力和ＨＳＰ７０ 含量的影響

熱休克蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)的指示器，它能使細(xì)胞處于保護(hù)狀態(tài)，它的產(chǎn)生能使細(xì)胞抵抗致死性損傷，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)外界損害的耐受力 。本試驗(yàn)過(guò)程中，在５ ｍｇ ／ Ｌ 的氨氮濃度脅迫下，各組刺參體腔液中免疫酶活力均表現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)。這主要是由于氨氮脅迫增強(qiáng)了刺參體內(nèi)水解系統(tǒng)的活性，表現(xiàn)出明顯的毒物興奮作用 。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酶制劑能**刺參的免疫性能，因此在短時(shí)間內(nèi)各加酶組表現(xiàn)出比對(duì)照組更迅速和強(qiáng)烈的免疫抵抗反應(yīng)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，刺參自身的水解系統(tǒng)活性降低，抵抗力下降 ，因此各組免疫酶活力隨后表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。氨氮脅迫７２ ｈ 內(nèi)，各組刺參體腔液中ＨＳＰ７０含量均呈上升趨勢(shì)。這說(shuō)明， 刺參通過(guò)**ＨＳＰ７０ 的表達(dá)量，增強(qiáng)抗逆性，以適應(yīng)氨氮脅迫的環(huán)境。氨氮脅迫開(kāi)始前（即０ｈ），復(fù)合酶組刺參體腔液中ＨＳＰ７０ 的含量明顯高于其他各組，其次為木聚糖酶組。氨氮脅迫４８ ｈ 內(nèi)，纖維素酶、淀粉酶和復(fù)合酶組刺參體腔液中ＨＳＰ７０ 含量與對(duì)照組相比表現(xiàn)出較快的升高，且復(fù)合酶組更早的達(dá)到**高點(diǎn)。這可能與酶制劑促進(jìn)刺參自身免疫和脅迫抵抗有關(guān)。

4　結(jié)論

① 飼料中適量添加木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶均能**刺參的生長(zhǎng)，**免疫能力，并對(duì)刺參體壁粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分的含量也有一定影響，且木聚糖酶的促生長(zhǎng)作用更明顯，而淀粉酶的促免疫作用更明顯。

② 氨氮脅迫下，飼料中適量添加聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶均能使刺參更迅速和強(qiáng)烈的表現(xiàn)出免疫抵抗反應(yīng)。